Pruebas in vitro del recubrimiento de sal de telas como agente antiviral potencial en mascarillas faciales reutilizables

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 17041 (2022) Citar este artículo

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Durante la pandemia de la enfermedad por coronavirus (COVID-19), el uso de mascarillas en espacios públicos se volvió obligatorio en la mayoría de los países. El riesgo de autocontaminación al manipular máscaras faciales, que fue una de las primeras preocupaciones, puede mitigarse agregando recubrimientos antivirales a las máscaras. En el presente estudio evaluamos la eficacia antiviral del cloruro de sodio depositado sobre un tejido apto para la fabricación de mascarillas de tela reutilizables utilizando técnicas adaptadas al entorno doméstico. Probamos ocho condiciones de recubrimiento, involucrando métodos de rociado e inmersión y tres diluciones de sal. Las partículas del virus de la influenza A H3N2 se incubaron directamente en los materiales recubiertos con sal, se recolectaron y se agregaron a cultivos epiteliales de vías respiratorias 3D humanas. La replicación del virus vivo en el epitelio se cuantificó a lo largo del tiempo en lavados apicales recogidos. En relación con el material no revestido, los depósitos de sal a 4,3 mg/cm2 o más redujeron notablemente la replicación viral. Sin embargo, incluso para grandes cantidades de sal, la eficacia del recubrimiento siguió dependiendo del tamaño y la distribución del cristal, que a su vez dependía de la técnica de recubrimiento. Estos hallazgos confirman la idoneidad del recubrimiento de sal como protección antiviral en las máscaras de tela, pero también enfatizan que se debe prestar especial atención al protocolo de recubrimiento al desarrollar soluciones para el consumidor.

En respuesta a la pandemia de la enfermedad por coronavirus (COVID-19) y siguiendo las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud1, la mayoría de los países han desarrollado estrategias y lineamientos para controlar la transmisión del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en general. población. Además del distanciamiento social, las pautas fomentan u ordenan el uso de máscaras faciales (ya sea desechables o reutilizables) en lugares públicos2. Esto ha llevado a un uso generalizado de mascarillas por parte de la población en general para frenar la transmisión de enfermedades respiratorias. El uso de mascarillas de tela reutilizables no médicas3, ya sean caseras o de producción comercial, fue una solución aceptada para la escasez inicial de mascarillas desechables4 y se reconoció de inmediato como un potencial para aumentar la sostenibilidad de las pautas de salud pública que se establecieron. . La protección que brindan las mascarillas faciales reutilizables contra la transmisión del virus depende de su rendimiento de filtración de partículas de 1 a 3 μm de diámetro5,6, que varía mucho según el material utilizado para fabricarlas7,8,9,10,11. Por encima de 3 μm, la eficiencia de filtración suele ser del 100 % para la mayoría de los textiles comunes10, lo que resulta en el bloqueo eficiente de cualquier partícula con un diámetro > 3 μm que pueda entrar en contacto con la mascarilla. Debido a que las partículas de este tamaño pueden transportar grandes cargas de virus12, cubrir la superficie de la máscara con un agente antiviral puede reducir la transmisión por fómites.

Durante las etapas iniciales de la pandemia de COVID-19, las preocupaciones sobre el riesgo de autocontaminación1 han alimentado un debate sobre si la población general no capacitada debería usar mascarillas debido al temor de que la autocontaminación compense los beneficios de su uso13. En este contexto, la comunidad científica abogó fuertemente por el uso de máscaras14,15, lo que fue respaldado por estudios16,17 y modelos matemáticos18,19. Por lo tanto, recubrir la superficie de la máscara con agentes antivirales puede ayudar a reducir la transmisión indirecta de virus respiratorios20,21,22. Los metales y los óxidos metálicos, los polímeros antimicrobianos, los materiales fotorreactivos o derivados del carbono y las biomoléculas se han considerado como recubrimientos de mascarillas antivirales23,24,25,26,27 y se han revisado ampliamente13,28,29. Quan et al.20 describieron un método simple para recubrir máscaras faciales quirúrgicas hechas de polipropileno no tejido (melt-soplado) con cloruro de sodio (NaCl). Informaron que las partículas virales de la influenza H1N1 se inactivaron mediante la alteración física de su cápside en 5 minutos debido a la disolución local y la recristalización de la sal recubierta cuando se mojaba con aerosoles cargados de virus20,30. Este recubrimiento fue estable y mantuvo su eficacia incluso después del almacenamiento en condiciones adversas20. Posteriormente, los autores demostraron que los recubrimientos de sal funcionalizan las membranas inertes para la captura e inactivación eficientes de los patógenos transportados por el aire31. Para su uso en recubrimientos antivirales, el NaCl es seguro, económico, fácil de obtener y podría usarse en entornos no profesionales para la producción de mascarillas faciales reutilizables tanto caseras como comerciales.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar más a fondo la fórmula de solución salina reportada por Quan et al.20 para recubrir mascarillas faciales reutilizables hechas de telas comunes. Como las mascarillas de tela se lavan regularmente para su reutilización, los usuarios deberán renovar la capa de sal antiviral después de cada lavado. Por lo tanto, investigamos si los métodos de deposición de sal adecuados para uso doméstico, es decir, la pulverización y la inmersión, y los tejidos comunes recomendados para la fabricación de mascarillas faciales reutilizables10 afectarían las propiedades antivirales de la capa de sal depositada.

Seleccionamos un paño de limpieza doméstico universal como tela de prueba y lo recubrimos con concentraciones incrementales de sal a través de una aplicación de inmersión o rociado controlado automáticamente. Se evaluaron la cantidad de sal depositada y el tamaño y la distribución de los cristales para caracterizar las condiciones de recubrimiento antes de la exposición al virus. Las propiedades antivirales de los recubrimientos se probaron y compararon mediante bioensayos in vitro utilizando el virus de la influenza A H3N2 (A/H3N2, familia Orthomyxoviridae, género Alfainfluenzavirus, especie del virus de la influenza A, serotipo H3N2) cultivado en un tejido epitelial pulmonar tridimensional (3D). modelo de cultura.

Se definieron cinco condiciones de recubrimiento por pulverización y tres por inmersión. Se realizó la deposición por pulverización con la formulación salina que contenía Tween-20 como agente humectante20, una pieza de tela por condición, utilizando un dispositivo de pulverización cuya apertura de válvula se cambió de acuerdo con las unidades de carrera arbitrarias 1, 3, 5 y 10, etiquetadas como Spr S1 , Spr S3, Spr S5 y Spr S10, respectivamente. La formulación de pulverización se diluyó cinco veces para una muestra adicional con unidad de carrera 3 (Spr S3 Dil5 ×). El recubrimiento por inmersión se realizó en tres piezas de material por condición con la formulación de sal no diluida (Dip No Dil), quíntuple (Dip Dil5 ×) y diez veces diluida (Dip Dil10 ×). Se midió la cantidad de sal depositada en el tejido (mg/cm2), la distribución y el tamaño de los cristales de sal para caracterizar cada condición de recubrimiento, antes de la exposición a las partículas virales.

Los métodos de recubrimiento por rociado y por inmersión produjeron un aumento lineal de la sal depositada en los tejidos en relación con la unidad de carrera aplicada o la dilución de la concentración de sal de la solución de inmersión (Fig. 1).

Concentraciones de sal (cloruro de sodio, NaCl) depositadas en telas recubiertas por pulverización y por inmersión. Para los tratamientos de Spr, se preparó una sola pieza de material (42,25 cm2) y de ella se cortaron tres piezas (repeticiones de 1 cm2). Para los tratamientos de Dip se prepararon por separado tres muestras (7,5 cm2). (a) Recubrimiento por aspersión con unidades de carrera 1, 3, 5 y 10. Ecuación de línea de regresión: Y = 2.0805x − 2.076; R2 = 0,9774; R = 0,9886; p<0,05. (b) Recubrimiento por inmersión con una solución salina diluida 10 × , 5 × o sin dilución. Los datos son medias ± desviaciones estándar. Ecuación de la línea de regresión: Y = 45,256x + 0,3492; R2 = 0,9968; R = 0,9984; P < 0,0001. Las concentraciones de sal pesadas se muestran y expresan en miligramos por centímetro cuadrado.

Las micrografías electrónicas de barrido del material de prueba (Fig. 2) muestran que después de la deposición y la evaporación, los métodos de recubrimiento por pulverización y por inmersión produjeron una dispersión distribuida de cristales a lo largo de las fibras de la tela.

Imágenes de microscopía electrónica de barrido del material de prueba, recubierto de sal por métodos de rociado y inmersión. La formulación de sal se usó sin diluir o diluida. Los tratamientos de rociado permitieron la deposición de cantidades crecientes de sal variando la apertura de la válvula del dispositivo de rociado de acuerdo con unidades de carrera arbitrarias. (a) Sin revestimiento, (b) pulverización, formulación de sal sin diluir, unidad de carrera 1 (Spr S1), (c) pulverización, formulación de sal diluida cinco veces, unidad de carrera 3 (Spr S3 Dil5 ×), (d) pulverización, sin diluir formulación de sal, unidad de carrera 3 (Spr S3), (e) pulverización, formulación de sal sin diluir, unidad de carrera 5 (Spr S5), (f) pulverización, formulación de sal sin diluir, unidad de carrera 10 (Spr S10). Para los tratamientos de inmersión, los materiales de prueba se sumergieron en formulaciones de sal (g) diez veces diluidas (Dip Dil10 ×), (h) cinco veces diluidas (Dip Dil5 ×) e (i) sin diluir (Dip No Dil). Las flechas en las imágenes apuntan a ejemplos de cristales de sal y agregados encontrados en los materiales de prueba.

El tamaño de los cristales se determinó mediante el caudal de pulverización en el método de recubrimiento por pulverización y por la tasa de dilución de la solución de inmersión en el método de recubrimiento por inmersión. Con el método de recubrimiento por pulverización, los caudales bajos dieron como resultado pequeños cristales monodispersos, mientras que a caudales más altos, se formaron cristales polidispersos más grandes después del secado del líquido coalescente depositado en la superficie de la tela.

La muestra sin recubrir (Fig. 2a) y las muestras con los volúmenes depositados más bajos, Spr S1 (Fig. 2b) y Spr S3 Dil5 × (rociadas con un volumen más alto, pero con una concentración de sal más baja; Fig. 2c), tenían una apariencia similar. Se observaron muy pocos cristales de sal dispersos en las fibras de las muestras Spr S1 y Spr S3 Dil5 ×. Sin embargo, aunque no son visibles mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), había cristales de sal en las fibras de las muestras Spr S1 y Spr S3 Dil5 × según lo confirmado por espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX) (Fig. S1a y b complementarias). , respectivamente). Para los volúmenes de pulverización medios, Spr S3 y Spr S5, los cristales de sal eran más claramente visibles en las micrografías electrónicas de barrido; formaron pequeños agregados a lo largo de las fibras, más claramente en las muestras Spr S3 que en las muestras Spr S5 (Fig. 2d, e, respectivamente). En el volumen de pulverización más alto, es decir, muestras Spr S10 (Fig. 2f), se formaron cristales grandes que envolvieron varias fibras. En las muestras Spr S3, Spr S5 y Spr S10, además de los cristales grandes observados por SEM, se distribuyeron pequeños cristales de sal a lo largo de las fibras en todo el material como lo reveló EDX (Fig. S1c-e complementaria).

En el método de recubrimiento por inmersión, tanto las soluciones diluidas (Dip Dil10 × y Dip Dil5 ×) como las no diluidas (Dip No Dil) (Fig. 2g–i, respectivamente) dieron lugar a la formación de cristales de sal que cubrían las fibras. Como en las muestras de prueba rociadas, el tamaño promedio de los cristales en las fibras recubiertas por inmersión varió con la concentración de sal en la solución. La muestra Dip Dil10 × mostró cristales de sal de tamaño moderado (Fig. 2g), mientras que la muestra Dip No Dil se caracterizó por cristales de sal muy grandes que cubrieron completamente las fibras (Fig. 2i). Los materiales de prueba muy recubiertos con sal, es decir, las muestras Spr S10 y Dip No Dil, se volvieron muy rígidos durante la manipulación. Tal endurecimiento no se observó a concentraciones de sal más bajas.

Después del contacto directo con las muestras recubiertas, se recolectaron partículas virales y se usaron para inocular insertos de cultivo de células epiteliales de las vías respiratorias humanas MUCILAIR. Se ejecutó el mismo protocolo con muestras de tejido recubiertas por pulverización con una solución de Tween-20/agua al 1 % con pasadas 3, 5 y 10 (Tween Str3, Tween Str5 y Tween Str10). La integridad epitelial durante el curso de la infección viral se controló midiendo la resistencia transepitelial (TEER) en comparación con cultivos no infectados no tratados (simulacro) y cultivos infectados directamente (sin máscara). TEER es una medición dinámica y no invasiva que refleja la integridad del epitelio y normalmente oscila entre 200 y 600 Ω·cm2 en cultivos MUCILAIR no dañados32. La interrupción de las uniones celulares y la presencia de agujeros en el epitelio dan como resultado valores TEER por debajo de 100 Ω·cm2.

Veinticuatro horas después de la infección viral, todos los epitelios de MUCILAIR mostraron valores de TEER comparables con los del control simulado (Fig. 3). A las 72 h después de la infección (hpi), los valores de TEER disminuyeron por debajo de 100 Ω·cm2 en la condición de control sin máscara, lo que indica una alteración grave de la estructura epitelial debido a la intensa replicación viral. En promedio, todos los cultivos inoculados con virus recolectados después de la incubación con los materiales de prueba tratados retuvieron valores de TEER comparables con los del control simulado. Sin embargo, bajo las condiciones de prueba con las concentraciones más bajas de sal (Spr S1 y Spr S3Dil5 ×) y Tween-20 (Tween Str3 y Tween Str5), un cultivo replicado en cada grupo de tratamiento tuvo un valor TEER por debajo de 100 Ω·cm2. Por el contrario, en las condiciones de prueba con concentraciones más altas de sal y Tween-20, todos los cultivos replicados tenían valores de TEER similares a los del control simulado. A las 144 hpi, la integridad del tejido se vio gravemente afectada por la infección viral en todos los cultivos, independientemente de las condiciones de la prueba.

Mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en epitelios MUCILAIR a las 24, 72 y 144 h después de la infección. Se muestran las medias ± errores estándar; n = 3 en todos los tratamientos, excepto para las muestras no recubiertas (n = 5). La línea de puntos representa el límite de 100 Ω·cm2 de integridad del tejido. Cultivo de control simulado, no infectado y no tratado; Detergente Triton X-100 utilizado como control positivo.

Un análisis comparativo de la replicación del virus en las células solo se pudo realizar 24 y 72 h después de la infección; Las copias del genoma viral no fueron detectables en ninguna de las muestras antes de las 24 h. Más allá de las 72 hpi, la replicación viral en las células disminuyó notablemente en la condición de control sin máscara y alcanzó una meseta en la muestra sin recubrimiento, lo que sesgó la comparación entre los tratamientos (no se muestran los datos), como se ha encontrado previamente con este sistema epitelial32.

A las 24 hpi, las copias del genoma viral pudieron detectarse y cuantificarse en lavados apicales celulares recolectados del control sin máscara y las muestras tratadas con las concentraciones más bajas de sal (Spr S1, Spr S3Dil5 × y Spr S3) y Tween-20 (Tween Str3 y Tween Str5), pero no de las otras muestras (Fig. 4a, c).

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa TAQMAN para la determinación del número de copias del genoma (gc) del virus A/H3N2 en el medio apical de epitelios MUCILAIR infectados después del contacto directo del virus con un material de prueba no recubierto o un material de prueba recubierto con varias concentraciones de sal o Tween. (a) Recubrimientos de sal, log10 A/H3N2 número gc/mL cuantificado a las 24 y 72 h después de la infección. ( b ) Recubrimientos de sal, replicación viral a las 72 h después de la infección. (c) Recubrimientos de Tween, log10 A/H3N2 número gc/mL cuantificado a las 24 y 72 h después de la infección. ( d ) Recubrimientos de Tween, replicación viral a las 72 h después de la infección. Los datos se expresan como un porcentaje relativo a la media de log10 A/H3N2 virus gc number/mL cuantificado en el grupo de tratamiento infectado sin recubrimiento, que se normalizó al 100 %. Se muestran las medias ± errores estándar; n = 3 en todos los tratamientos, excepto sin recubrimiento (n = 5). *P < 0,05.

Setenta y dos horas después de la infección, se detectó virus en lavados apicales de todos los grupos de tratamiento de recubrimiento. Sin embargo, todos los tratamientos, incluidos los que no tienen recubrimiento (sin recubrimiento), afectaron la replicación viral como se refleja en una disminución en el número de copias del genoma viral en los lavados apicales del cultivo celular en comparación con el cultivo de control infectado (control sin máscara, Fig. 4b). En comparación con la condición sin recubrimiento, el recubrimiento con sal bajo los tratamientos Spr S3, Spr S10, Dip No Dil y Dip Dil10 × ejerció un efecto antiviral marcado adicional, significativo para Spr S3 (P = 0.0269) y Dip No Dil (P = 0,0454). Los números más bajos de copias del genoma A/H3N2 se obtuvieron en lavados apicales recolectados de los cultivos Spr S3 y Dip No Dil, que exhibieron reducciones log10 de 4.31 y 3.95, respectivamente, en el número de copias del genoma en comparación con los de los cultivos infectados, no infectados. cultivos de tratamiento recubiertos. Aunque no fue estadísticamente significativa, la disminución en la replicación viral bajo los tratamientos Spr S10, Dip Dil 5 × y Dip Dil fue aún notable, con reducciones log10 de 3.5, 2.99 y 3.65, respectivamente. No observamos una correlación clara entre la concentración de sal en el recubrimiento y los niveles de copia del genoma del virus, ya que los mejores resultados se obtuvieron con las muestras Spr S3 y Dip No Dil, con concentraciones de sal de 4,73 y 45,54 mg/cm2, respectivamente. Una actividad antiviral relevante parecía lograrse por encima de un cierto umbral de depósitos de sal en la superficie del material. El tratamiento con Spr S5 fue la única excepción a esta observación, que podría haber resultado en una reducción más prominente en el número de copias del genoma. Sin embargo, dos de las tres réplicas exhibieron marcadas reducciones log10 de 3,74 y 3,54 en el número de copias del genoma, mientras que solo una réplica no mostró ningún efecto sobre la replicación viral.

En las condiciones de prueba de Tween-20 (Fig. 4c, d), solo la concentración más alta de Tween-20, es decir, el tratamiento con Tween Str10, afectó notablemente la replicación viral, con una reducción log10 de 3,57 en el número de copias del genoma en comparación con los de las muestras de prueba no recubiertas.

Debido a que la cuantificación de la copia del genoma del virus en los lavados apicales celulares puede no ser un indicador completo del potencial de infectividad de las partículas virales, determinamos la dosis de infectividad tisular del 50% (TCID50) para condiciones de prueba seleccionadas (Fig. 5) realizando titulaciones de virus en células de riñón canino Madin-Darby transfectadas con ADNc que codifica α-2,6-sialiltransferasa humana (MDCK-SIAT1).

Títulos de virus A/H3N2 en el medio apical de epitelios MUCILAIR infectados después del contacto directo del virus con un material de prueba no recubierto o material de prueba recubierto con varias concentraciones de sal, determinados a las 72 h después de la infección. Los datos se expresan como un porcentaje relativo a la media de log10 TCID50/mL en el grupo de tratamiento infectado sin recubrimiento, que se normalizó al 100 %. Se muestran las medias ± errores estándar; n = 3. **P < 0,01; *** P < 0,001.

Como se observó anteriormente para el número de copias del genoma, los títulos de virus fueron significativamente más bajos en las condiciones de prueba Spr S3 (P = 0,000752), y también en las condiciones Spr S10 (P = 0,00318) y Dip Dil 10 × (P = 0,000856), que en las condiciones no -condición de prueba recubierta. Los resultados del ensayo TCID50 coincidieron con los obtenidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR), que indicó una marcada disminución en el número de partículas virales que pudieron sobrevivir y replicarse después de 10 minutos de contacto directo con el virus. telas recubiertas de sal.

Para recolectar partículas de virus, el material de prueba inoculado se incubó durante 5 min en medio celular. Aunque la solución que contenía el virus se diluyó 1:10 con medio celular antes de la infección celular, el contenido de sal todavía estaba por encima de la isotonicidad en la mayoría de las muestras de células (Tabla complementaria S1) y puede haber afectado la penetración del virus en las células. Para verificar que la desactivación del virus se debió únicamente al contacto directo de las partículas virales con los tejidos salinos, y no durante la etapa de recolección o la fase de inoculación del epitelio MUCILAIR, incubamos partículas de virus A/H3N2 en 0,9%, 3,5 %, y soluciones salinas al 35%. La infectividad viral no se vio afectada por el tratamiento y las copias del genoma viral se pudieron cuantificar a las 24 hpi (Fig. 6a), en todas las condiciones de prueba.

Efecto de la preincubación del virus en soluciones salinas hipertónicas sobre la replicación viral en las células. (a) Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa TAQMAN para la determinación de copias del genoma del virus A/H3N2 (gc) en el medio apical de epitelios MUCILAIR infectados después de la incubación del virus en soluciones salinas de varias concentraciones. Los datos se expresan como log10 A/Número de gc de H3N2/mL, cuantificados a las 24 y 72 h después de la infección. Se muestran las medias ± errores estándar; n = 3. (b) Mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en epitelios MUCILAIR 24, 72 y 144 h después de la infección. Se muestran las medias ± errores estándar; n = 3. La línea de puntos representa el límite de 100 Ω·cm2 de integridad del tejido. Cultivo de control simulado, no infectado y no tratado; Triton X-100, detergente utilizado como control positivo.

A las 72 hpi, el número de copias del genoma aumentó en un factor log10 de 2 a 3 en las tres condiciones de prueba de solución salina, similar al medio de control. Los resultados del TEER respaldaron que los tratamientos con solución salina fueron ineficaces para controlar la infección viral. Al igual que en el medio de control, los valores TEER cayeron por debajo de 100 Ω·cm2 a las 72 hpi en los tres grupos de prueba con solución salina (Fig. 6b). En todas las muestras, la integridad epitelial se interrumpió rápidamente debido a la extensa replicación viral, incluso después de la incubación del virus en una solución salina saturada (solución salina al 35%) durante 10 minutos.

El presente estudio amplió los hallazgos de Quan et al.20 sobre material que tiene buenas propiedades de filtración de partículas, que se puede lavar e integrar en mascarillas faciales reutilizables10. Además, utilizamos técnicas de recubrimiento con sal aplicables en un entorno doméstico. Finalmente, verificamos la propiedad antiviral del recubrimiento de sal con un entorno de laboratorio simple, en epitelios de vías respiratorias 3D no modificados humanos33,34. Este modelo de prueba podría aplicarse a otros tipos de recubrimiento antiviral en varios materiales.

Los dos métodos de deposición de sal, rociado y recubrimiento por inmersión, condujeron a la formación de cristales en las superficies de la tela, y el tamaño de los cristales de sal dependía de la dilución y el volumen. Excepto por las condiciones de recubrimiento de concentración más baja, Spr S1 y Spr S3 Dil5 × , que fueron ineficaces aunque la sal estaba bien distribuida en las muestras de tejido, todas las demás condiciones de prueba dieron como resultado un efecto claro de los depósitos de sal sobre la actividad viral. En esas muestras, el número de copias del genoma viral fue muy bajo o no detectable 24 hpi. La replicación viral todavía se redujo en 3–4 log10 72 hpi en cinco condiciones de prueba, es decir, Spr S3, Spr S10, Dip No Dil, Dip Dil5 × y Dip Dil10 ×. Estos resultados fueron confirmados por los resultados del ensayo TCID50 que mostraron que menos partículas de virus pudieron infectar las células después de haber estado en contacto directo con las telas recubiertas de sal. Estos hallazgos están en línea con los de estudios previos que demostraron los efectos de la deposición de sal en el filtro interior de las mascarillas quirúrgicas seguido de la inoculación del virus de la influenza A/H1N120 y la pulverización de sal en la capa exterior de las mascarillas quirúrgicas y la posterior inoculación con un virus porcino (virus transmisible de la gastroenteritis)35. Sin embargo, no hubo una clara correlación negativa entre las concentraciones de sal en los tejidos y el número de copias del genoma viral en cultivos celulares. La reducción más fuerte en partículas de virus se observó para dos concentraciones de recubrimiento de sal muy diferentes, Spr S3 (4,73 mg/cm2) y Dip No Dil (45,54 mg/cm2). Las otras condiciones de recubrimiento en este rango suprimieron la replicación viral en niveles más bajos, pero aun así redujeron la carga viral en un factor log10 de 3. En contraste, los tratamientos Spr S1 (0.58 mg/cm2) y Spr S3 Dil5 × (0.41 mg/cm2) fueron claramente insuficientes para controlar la replicación viral, y sugerimos que se necesita una concentración de sal umbral para inhibir la replicación viral. Cabe señalar aquí que las cantidades efectivas de sal depositada informadas por Quan et al.20 estaban entre 6,16 mg/cm2 y 24,64 mg/cm2, que está dentro del rango de cantidades de sal depositadas en nuestras muestras activas.

El efecto antiviral de un recubrimiento de sal parece ser una consecuencia de la ruptura de la cápside del virus por la disolución local de la sal seguida de la recristalización20,30. Este efecto puede variar no solo con la cantidad de sal en el revestimiento, sino también con la distribución y el tamaño de los cristales de sal en los tejidos, que a su vez depende de varios parámetros y técnicas de deposición de sal. Esto puede explicar la escasa correlación negativa observada en este estudio entre la concentración de sal en los tejidos y la desactivación viral por encima de un determinado umbral de concentración de sal.

Paralelamente a la hipótesis de la disolución/recristalización de la sal, consideramos la posibilidad de que los residuos de sal disueltos durante el paso de recolección del virus también puedan haber contribuido a la desactivación viral debido a la hipertonicidad del medio, como se mostró anteriormente para los microorganismos en el aire35. Para probar esta hipótesis, las partículas del virus A/H3N2 se incubaron directamente en soluciones de diferentes concentraciones de sal, desde la isotonicidad hasta la saturación, antes de su inoculación en los cultivos de células MUCILAIR. Los resultados revelaron que las soluciones salinas no tuvieron ningún efecto sobre la replicación viral a lo largo del tiempo y no contribuyeron a conservar la integridad de las células epiteliales (TEER) en comparación con el medio de control. En los experimentos de revestimiento de telas, las concentraciones de sal en el paso de recolección de virus estaban claramente dentro del rango de las soluciones salinas analizadas (0,95 a 5,46 % para revestimiento frente a 0,90 a 17,9 % para soluciones salinas; Tabla complementaria S1). De manera similar, en un sistema de prueba que involucra SARS-CoV-2, la preincubación del virus con soluciones salinas de hasta el 1,7 % no alteró la replicación viral en células Vero36, y la incubación del virus A/H3N2 en NaCl 1 M (5,8 %) La solución durante hasta 1 hora no disminuyó los títulos de hemaglutinina ni las unidades formadoras de placas en las células MDCK-SIAT1 en comparación con un control de solución salina tamponada con fosfato37. Estos resultados confirmaron que la incubación de las partículas virales sobre el tejido revestido fue la única responsable de la desactivación viral, como también demostraron recientemente Rubino et al.30. El efecto de inactivación se puede atribuir a las propiedades de formación de cristales de las sales más que al tipo de sal utilizada, ya que otras sales, como el cloruro de potasio (KCl), el sulfato de potasio (K2SO4)30 y el dihidrogenofosfato de sodio (NaH2PO4)37, Se ha demostrado que producen un efecto similar cuando se recubren con máscaras quirúrgicas.

Además de la ruptura mecánica de la cápside debido a la disolución/recristalización de la sal, se ha sugerido que el aumento del estrés osmótico durante la recristalización de la sal conduce a la deformación y daño de la cápside del virus, lo que resulta en la desactivación20,30,38.

Debido a que la solución salina contenía Tween-20 al 1%, investigamos si este surfactante también podría haber desempeñado un papel en la desactivación viral. Tween-20 es un surfactante suave que puede romper las interacciones lípido-proteína y solubilizar las membranas39 y, por lo tanto, puede afectar la cápside del virus de la influenza A, que es un conjunto de proteínas incrustadas en una membrana lipídica40. En el presente estudio, se probaron tres concentraciones de pulverización basadas en tamaños de carrera, que también se usaron en el método de recubrimiento con sal, es decir, carreras 3, 5 y 10. Solo la concentración más alta de Tween-20, en el tratamiento con Tween Str10, afectó notablemente la replicación viral en células MUCILAIR con una reducción log10 de 3,57. Esto muestra que Tween-20 también puede haber contribuido a la desactivación viral en las muestras con las concentraciones de sal más altas. De acuerdo con esto, se informó que Tween-20 reduce la supervivencia del virus del herpes en una concentración de 1%41 o 0,25%42.

Independientemente de estas consideraciones técnicas, los hallazgos del presente estudio confirman que la sal puede formar una barrera antiviral protectora no solo en las máscaras quirúrgicas, sino también en los materiales domésticos que podrían usarse en máscaras de tela lavables. Dado que el efecto antiviral de la sal fue generado por la alteración física de la cápside viral, es razonable suponer que otros virus envueltos, como el SARS-CoV-2, podrían verse afectados de manera tan eficiente incluso si no están estrechamente relacionados con A/ H3N2. Esta actividad antiviral cruzada específica vinculada a la alteración de la cápside se ha informado para el SARS-CoV-2 (ARN monocatenario de sentido positivo) y el bacteriófago phi6 (ADN bicatenario) después del contacto con tela no tejida spunlace recubierta con extracto de arándano rojo26. El modelo actual con influenza A/H3N2 y epitelio nasal humano MUCILAIR se puede implementar en una amplia gama de instituciones, ya que solo requiere el nivel de bioseguridad dos (BSL-2), mientras que el uso de SARS-CoV-2 requeriría BSL-3. Este modelo que utiliza epitelios nasales humanos podría extenderse aún más a la evaluación de otros recubrimientos antivirales y para varios tipos de equipos de protección personal, teniendo en cuenta que las interacciones entre el virus y el recubrimiento antiviral pueden simplificarse demasiado y que los resultados positivos deben confirmarse con un sistema más sofisticado que involucra partículas virales en aerosol.

Para recubrir máscaras faciales de tela reutilizables, ambos métodos de deposición de sal utilizados en este estudio se pueden adaptar para uso doméstico para renovar la capa protectora de sal en la máscara después del lavado. Se debe prestar especial atención al uso de una solución salina suficientemente concentrada para alcanzar el umbral de actividad antiviral, evitando cargas excesivas de sal que hacen que la máscara sea más rígida y menos cómoda, como se observa para los recubrimientos Spr S10 y Dip No Dil. Sin embargo, las propiedades de transpirabilidad y filtración de partículas, que son parámetros importantes para la elección del material para fabricar mascarillas faciales reutilizables10, probablemente apenas se verían afectadas por el recubrimiento de sal en el rango de cantidades de sal utilizadas en el presente estudio, y como se demostró previamente con poros grandes. membranas de polipropileno recubiertas con concentraciones cercanas de NaCl, KCl o K2SO431. Los surfactantes fáciles de comprar, como el jabón de manos, podrían reemplazar efectivamente a Tween43. Las soluciones de niebla salina listas para usar pueden convertirse en una opción conveniente para lograr un recubrimiento de sal óptimo con una distribución y un tamaño de cristales de sal adecuados. Recientemente se ha probado con éxito un dispositivo de solución de niebla salina al 10 %35.

El material de prueba fue una tela de microfibra no tejida universal hecha de 80 % poliéster y 20 % nailon (JEMAKO Pro Cloth Plus, Jemako, Rhede, Alemania). Este material, ampliamente disponible en tiendas minoristas, exhibe buenas propiedades de filtración de partículas y transpirabilidad9,10,44.

La solución salina estaba compuesta por NaCl al 29,03 % p/v (29,03 g/100 ml) (Merck, Darmstadt, Alemania) en agua desionizada con Tween-20 al 1,0 % v/v (1 ml/100 ml) (Merck), como informado por Quan et al.20. La solución salina se probó en formas no diluidas y diluidas (dilución de 5 o 10 veces en agua desionizada). Se añadió Tween-20, un tensioactivo no iónico, a la solución salina para humedecer adecuadamente las fibras de poliéster hidrofóbico20. Para evaluar el efecto de Tween-20, se preparó una solución de Tween-20 al 1,0 % v/v (1 ml/100 ml) en agua desionizada.

Utilizamos dos procedimientos de recubrimiento automatizados: pulverización y inmersión. La deposición del recubrimiento por aspersión se logró utilizando una miniválvula de aspersión (EFD 781; Nordson, Westlake, OH, EE. UU.) montada en un robot automatizado (JR2304; Janome, Tokio, Japón). Este sistema permitió el control de la cantidad total de sal depositada mediante el ajuste de parámetros, incluida la velocidad de deposición (ajustada a 40 mm/s), la distancia entre el rociador y el sustrato (ajustada a 40 mm) y la presión aplicada sobre el cartucho que contiene la solución salina (ajustado a 0,4 bar). El patrón de deposición constaba de líneas rectas paralelas separadas 4 mm. La carrera (apertura de la válvula que controla el flujo) se varió con las unidades de carrera arbitrarias 1, 3, 5 y 10, denominadas Spr S1, Spr S3, Spr S5 y Spr S10, respectivamente. Para evaluar el efecto de la dilución a volumen constante, se preparó una muestra adicional con unidad de carrera 3 con una solución de recubrimiento diluida cinco veces (Spr S3 Dil5 ×). Se trató una pieza de material de prueba por condición con un tamaño de 6,5 cm × 6,5 cm.

El recubrimiento por inmersión se realizó utilizando un recubridor por inmersión automatizado (KSV Nima (tamaño mediano); Biolin Scientific, Espoo, Finlandia). Se prepararon tres piezas de material de prueba por condición, de tamaño 2,5 × 3 cm. El recubrimiento por inmersión se realizó utilizando tres concentraciones de sal: no diluida, diluida 5 × y diluida 10 × (etiquetadas Dip No Dil, Dip Dil5 × y Dip Dil10 ×, respectivamente). Las piezas de tela se sumergieron completamente en la solución durante 3 s y se retiraron a una velocidad constante de 100 mm/min. Las piezas se suspendieron verticalmente y se dejaron escurrir durante 30 min.

Para evaluar el efecto antiviral potencial de Tween-20, se pulverizó una solución de Tween-20/agua al 1 % sobre el material de prueba utilizando el dispositivo de pulverización y las condiciones anteriores. Se aplicaron las pasadas de pulverización 3, 5 y 10, etiquetadas como Tween Str3, Tween Str5 y Tween Str10, respectivamente. Las muestras se secaron, almacenaron y manipularon de la misma manera que las muestras cubiertas con sal.

Después del recubrimiento, el material se secó a temperatura ambiente (20 °C) durante la noche y se almacenó en bolsas de plástico limpias y selladas en atmósfera de nitrógeno. Para todas las muestras recubiertas de sal, la sal depositada se cuantificó pesando la muestra antes del recubrimiento y después del secado. Para determinar el tamaño y la distribución de los cristales de sal en los materiales, las muestras recubiertas se analizaron mediante SEM y EDX. Los protocolos se describen en la Información complementaria.

Los modelos de células de las vías respiratorias humanas MUCILAIR-HF (Epithelix, Ginebra, Suiza) son epitelios de las vías respiratorias en 3D totalmente maduros y funcionales cocultivados con fibroblastos. Los epitelios de MUCILAIR (número de lote HF-MP0009) se reconstituyeron con células epiteliales nasales aisladas de 14 donantes sometidos a polipectomía nasal quirúrgica (edad, 24–58 años, mediana, 53 años) y se cocultivaron con fibroblastos humanos en insertos TRANSWELL (Corning, Glendale , Arizona, EE. UU.)32. Todos los procedimientos experimentales para obtener las muestras de células se explicaron en su totalidad y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio se realizó de acuerdo con la declaración de Helsinki sobre investigación biomédica (enmienda de Hong Kong, 1989), y el protocolo de investigación fue aprobado por la comisión de ética local. Se usaron cultivos maduros (66 días de edad) en los experimentos antivirales. Se verificó la calidad de los cultivos celulares antes de su uso, como se describe en la Información complementaria.

Las partículas del virus A/H3N2 se aislaron originalmente directamente en el epitelio MUCILAIR de una muestra clínica33, y el linaje, A/Switzerland/8004462/2013(H3N2), se identificó mediante PCR, un ensayo de inhibición de la hemaglutinación y secuenciación parcial del gen de la neuraminidasa. Se produjeron stocks de este aislado en cultivos MUCILAIR mediante la recolección de lavados apicales con medio de cultivo y se utilizaron con éxito en experimentos de infección32,33. El procedimiento de producción completo se describe en la Información complementaria.

Inmediatamente antes de la exposición al virus, el material recubierto se retiró de las bolsas a temperatura ambiente (26% de humedad relativa), se cortó en piezas de 1 cm2 con tijeras y se colocó en cajas de Petri estériles. Todas las operaciones se realizaron en un ambiente limpio y seco. Además, se prepararon piezas de 1 cm2 del material sin recubrir para que sirvieran como muestras de control. Ambos lados de las piezas de tela fueron esterilizados por radiación ultravioleta-C durante 30 min, utilizando una lámpara UV900 G30T8 (a 12,0 W durante 100 h; Philips Lighting, Lamotte-Beuvron, Francia).

Antes de la inoculación viral, los insertos de epitelio MUCILAIR se colocaron en placas de 24 pocillos que contenían 500 µl/pocillo de medio de cultivo MUCILAIR y se lavaron con 200 µl de medio de cultivo MUCILAIR a 34 °C durante 10 min. Se colocaron tres piezas de material de prueba por condición de recubrimiento y cinco piezas de material sin recubrimiento, de 1 cm2 de tamaño cada una, en pocillos separados de una placa de 24 pocillos (CORNING COSTAR 3526; Corning, NY, EE. UU.). A partir del stock de virus, se preparó una solución que contenía 2 × 108 copias del genoma en medio de cultivo MUCILAIR. Se depositaron cinco microlitros de la preparación A/H3N2 (106 gc) sobre cada pieza del material de prueba. Después de 10 min de exposición directa, se agregó 1 mL de medio MUCILAIR a cada pocillo que contenía una muestra de prueba para recolectar el virus. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente, seguido de una mezcla mediante movimientos de pipeteo, el medio que contenía las partículas virales se transfirió a una nueva placa de 24 pocillos y se diluyó 1:10 en medio MUCILAIR. Luego, se aplicaron apicalmente 100 µL de la solución a las células cultivadas en insertos MUCILAIR para la infección a 34 °C, 5 % de CO2 y 100 % de humedad relativa durante 3 h. Luego se descartó el inóculo de virus y las células se lavaron tres veces con 200 μL de medio MUCILAIR. A las 3,5, 24, 72 y 144 h posteriores a la inoculación viral, se añadieron 200 μL de medio MUCILAIR a las células, que luego se incubaron durante 20 min (34 °C, 5 % de CO2 y 100 % de humedad relativa). Los lavados apicales se recolectaron y almacenaron a –80 °C hasta la cuantificación de copias del genoma o titulaciones virales. Se incluyeron como controles muestras no recubiertas (Non Coated) y cultivos infectados directamente (Control sin máscara). La integridad epitelial durante el experimento se controló midiendo TEER. Los cultivos MUCILAIR no infectados y no tratados (simulados) y los cultivos tratados con el detergente Triton X-100 sirvieron como control negativo y positivo adicional para la medición de TEER. El medio debajo de los pocillos de insertos de MUCILAIR se cambió una vez a las 48 hpi con 500 µL de medio de cultivo MUCILAIR nuevo.

Se prepararon soluciones salinas a concentraciones de 0,9%, 3,5% y 35% en agua desmineralizada. Una solución de virus A/H3N2 (5 µL) que contenía 106 copias del genoma se diluyó 1:1 con medio de cultivo MUCILAIR (Medio de control) o con las diversas soluciones salinas y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. El medio de control y las soluciones salinas que contenían el virus se diluyeron 1:10 en medio de cultivo MUCILAIR y se inocularon apicalmente 100 µl de las diluciones en insertos de MUCILAIR (n = 3) para la infección durante 3 h. Los virus se recogieron y cuantificaron a las 3,5, 24, 72 y 144 h después de la infección. La integridad epitelial durante el experimento se controló midiendo TEER.

La integridad del epitelio de MUCILAIR se evaluó a las 24, 72 y 144 horas después de la infección midiendo TEER32,33 (voltímetro-ohmímetro EVOMX, World Precision Instruments, Stevenage, Reino Unido).

La replicación viral se evaluó a las 3,5, 24, 72 y 144 h después de la infección mediante la cuantificación de las copias del genoma utilizando la sonda RT-qPCR TAQMAN (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Ambos métodos se describen en la Información complementaria.

Usamos células MDCK-SIAT1 para la titulación viral (Merck). Esta línea celular se estableció a partir de la transfección estable de células MDCK con ADNc que codifica la α-2,6-sialiltransferasa humana (SIAT1) para sobreexpresar ácidos siálicos unidos a 645. Las células se cultivaron en medio de crecimiento que consistía en medio de Eagle modificado por Dulbecco con GlutaMAX (31,966,021; Life Technologies, ThermoFisher Scientific) suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (v/v) (2-01F16-I; BioConcept Ltd, Allschwil/Basel, Suiza), 1 % de aminoácidos no esenciales (10 938 025; Life Technologies, ThermoFisher Scientific) y 1 % de penicilina-estreptomicina (15 140 122; Life Technologies, ThermoFisher Scientific). El medio de infección sin suero fue penicilina-estreptomicina al 1 % en medio de Eagle modificado por Dulbecco, y el medio de ensayo fue medio sin suero complementado con 1 µg/mL de tripsina (T1426; Merck). Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. Las monocapas confluentes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y se añadió medio sin suero. Las células se inocularon por cuadruplicado con diluciones en serie de diez veces de una solución de virus y se incubaron a 37 °C durante 1 h para la infección. Luego, se aspiró el inóculo, se agregó el medio de ensayo y las células se incubaron a 37 °C. Cuatro días después de la infección, se observó y cuantificó al microscopio óptico la presencia de efecto citopático, visible como el desprendimiento de células muertas de la monocapa. Se usaron lavados apicales de epitelios nasales de MUCILAIR infectados con A/H3N2 recolectados 72 h después de la infección para la titulación del virus y la cuantificación de las copias del genoma para las siguientes condiciones de prueba: Spr S1, Spr S3, Spr S10, Dip Dil10 ×, Control sin máscara, Sin revestimiento y Tween Str3. Los títulos virales se determinaron mediante el método de punto final de Reed y Muench46 y se expresaron como log10 TCID50/mL.

El número de copias del genoma y los títulos virales tienen una distribución logarítmica normal47,48,49. Se planificaron algunas comparaciones científicamente sensatas en el diseño del estudio: el número de copias del genoma basado en log10 y los títulos virales en el control no recubierto se compararon con los tratamientos recubiertos con sal y Tween mediante la prueba t de Student de dos muestras con la modificación de Welch a la grados de libertad (una cola, función R t-test)50. La hipótesis nula fue que las verdaderas medias en las muestras sin recubrimiento y con tratamientos recubiertos con sal y Tween eran iguales, y la hipótesis alternativa fue que las verdaderas medias en las muestras con tratamientos recubiertos fueron menores que las del control sin recubrimiento. Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos y llevaron al rechazo de la hipótesis nula.

Los conjuntos de datos generados y analizados en el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer al Dr. Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy por editar un borrador de este manuscrito. La investigación sobre los materiales y el revestimiento de las mascarillas se llevó a cabo utilizando Taxila, una plataforma de análisis de texto y extracción de conocimientos desarrollada por SBX Corporation, Tokio, Japón.

Este trabajo recibió financiación y apoyo de Philip Morris International, Epithelix Sàrl y Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique (CSEM) SA. El proyecto, bajo el nombre de consorcio ProMask.CH, fue cofinanciado por el Cantón de Berna, Suiza, a partir de los préstamos de emergencia Corona diseñados para apoyar la economía local durante la crisis de COVID-19.

Estos autores contribuyeron por igual: Sandra Schorderet Weber, Xavier Bulliard y Rosy Bonfante.

I+D de PMI, Philip Morris Products SA, Quai Jeanrenaud 5, 2000, Neuchâtel, Suiza

Sandra Schorderet Weber, Yang Xiang, Sandro Steiner, Alexandra Laurent, Shoaib Majeed, Stefan Lebrun, Arkadiusz Kuczaj, Manuel C. Peitsch, Julia Hoeng y Adrian Stan

Centro Suizo de Electrónica y Microtecnología SA (CSEM), Rue Jaquet-Droz 1, 2002, Neuchâtel, Suiza

Xavier Bulliard, Silvia Biselli, Raphael Pugin & Michele Palmieri

Epithelix Sàrl, Chemin des Aulx 18, 1228, Plan-les-Ouates, Ginebra, Suiza

rosy bonfante & samuel constante

Coat-X SA, Eplatures-Grise 17, 2300, La Chaux-de-Fonds, Suiza

andreas hogg

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El estudio fue diseñado por SC, JH, RP y XB. El trabajo de laboratorio y la recopilación de datos estuvieron a cargo de RB, SC, XB, SB, AL y SM. El análisis y la interpretación de datos fueron realizados por SC, SSW y AS y las estadísticas realizadas por La logística del estudio YX fue apoyada por SS, AL, SM, XB y SL El primer borrador del manuscrito fue escrito por SSWAS, SS, JH y AK comentaron las versiones preliminares. JH, MCP, MP, AS y AH apoyaron y financiaron el trabajo. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Sandra Schorderet Weber.

Los autores SSW, YX, SS, AL, SM, SL, AK, MCP, JH y AS son empleados de Philip Morris International. Los autores SC y RB son empleados de Epithelix Sàrl, y los autores XB, SB, RP y MP son empleados de CSEM SA. El autor AH es un empleado de Coat-X SA.

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Reimpresiones y permisos

Schorderet Weber, S., Bulliard, X., Bonfante, R. et al. Pruebas in vitro del recubrimiento de telas con sal como posible agente antiviral en mascarillas faciales reutilizables. Informe científico 12, 17041 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21442-7

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Recibido: 11 Abril 2022

Aceptado: 27 de septiembre de 2022

Publicado: 11 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21442-7

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Pruebas in vitro del recubrimiento de sal de telas como agente antiviral potencial en mascarillas faciales reutilizables